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Soutenance de thèse de Maroua Gdoura

Faculté des Sciences de Sfax (Tunisie), salle des thèses

Maitrise des risques de contamination des produits alimentaires par le groupe B. cereus

Thèse en cotutelle dirigée par Michel Gautier (UMR STLO) et Radhouane Gdoura (Université de Sfax)

Résumé

Les membres du groupe B. cereus, y compris des souches pathogènes capables de provoquer des intoxications alimentaires émétiques et/ou diarrhéiques, sont présents dans de nombreux aliments qui peuvent s’en trouver altérés ou contaminés et s’avérer dangereux pour la consommation. Leur contrôle constitue dès lors une préoccupation majeure. Dans ce cadre, cette thèse vise d’une part à isoler et identifier ce pathogène à partir d’échantillons alimentaires collectés dans le Sud-Est Tunisien, d’étudier sa diversité génétique et d’évaluer le niveau de risque en matière de sécurité sanitaire des aliments. D’autre part, elle vise à isoler et caractériser des bactériophages infectant le groupe B. cereus dans le but d’évaluer leur efficacité comme moyen de lutte contre les biofilms pouvant se former à la surface des installations en IAA. Sur 687 matrices alimentaires analysées, 191 échantillons positifs ont donné lieu à la création d’une collection de 191 isolats du groupe B. cereus. Cent-soixante-quatorze isolats se sont avérés posséder le gène sspE, spécifique du groupe. Ces isolats sont caractérisés par une forte diversité génétique (143 profils PFGE et 99 profils ERIC-PCR) et par un profil thermique intermédiaire avec la coexistence de deux séquences signatures « 16S rDNA-1 m » et « 16S rDNA-2 p » portées par le gène codant pour l’ARNr 16S. Une prédominance du groupe phylogénétique III, qui est potentiellement pathogène, a été révélée pour 60,9% des isolats. Les tests d’adhésion à l’inox ont montré que 73% des isolats sont caractérisés par un taux d’adhésion plus important pour les spores par rapport aux cellules végétatives. Les isolats hébergent au moins l’un des gènes de chacun des complexes NHE et HBL, associé ou non aux gènes bceT, cytK 2 et ces. La distribution des facteurs de virulence a permis de classer les souches en douze groupes toxinogènes. Après incubation en milieu BHI-YE à 30°C, 70,7% et 35% des isolats se sont avérés cytotoxiques après 18 h et 5 j, respectivement. Différentes combinaisons de facteurs de virulence sont associées de façon significative au potentiel cytotoxique des bactéries. De plus, un lien apparait clairement entre la cytotoxicité des bactéries et le type d’aliment dont elles sont issues. La majorité des isolats s’est montré sensible à de nombreux agents antimicrobiens mais présentait une résistance à l'ampicilline et à la novobiocine. L’isolement des bactériophages infectant le groupe B. cereus en combinant la technique de l’enrichissement des échantillons en bactéries cibles suivie d’une analyse du spectre d’hôte des plaques de lyse obtenues, a permis de sélectionner 7 bactériophages à large spectre. Ces derniers appartiennent à la famille des Siphoviridae de l’ordre des Caudovirales. A l’exception de deux phages qui présentaient un profil protéique similaire, les 5 autres phages possédaient chacun un profil protéique unique. Tous les phages isolés ont des profils de restriction similaires avec une taille de génome estimée à 37 kb environ. Les bactériophages isolés se sont montrés efficaces pour prévenir la formation de biofilms et des réductions allant jusqu’à 1,5 log UFC/cm2 ont pu être obtenues par rapport au biofilm non traité. Le traitement curatif a permis quant à lui de diminuer la densité bactérienne de 0,5 log UFC/cm2. Ce travail confirme le risque sanitaire lié à la présence du groupe B. cereus et le rôle des bactériophages comme outil prometteur pour le biocontrôle des bactéries pathogènes au sein de la filière agro-alimentaire.

Mots clès : groupe B. cereus, échantillons alimentaires, contamination, risque sanitaire, diversité, biofilm, bactériophages, biocontrôle, Tunisie

Contamination risks control of food products by B. cereus group

Members of the B. cereus group, including pathogenic strains, which may lead to emetic and/or diarrheal food poisoning, are present in many foods that may be altered or contaminated and become dangerous for the consumer. Their control is therefore of major concern. In this context, this thesis aims, on the one hand, at isolating and identifying this pathogen from food samples collected in South-East Tunisia, studying its genetic diversity and assessing the level of risk in terms of food safety. On the other hand, it aims at isolating and characterizing the bacteriophages infecting the B. cereus group in order to evaluate their effectiveness as a means of controlling biofilms that may form on the surfaces of food industry installations. Out of 687 food matrices analysed, 191 positive samples resulted in a collection of 191 B. cereus group isolates. One-hundred-seventy-four isolates were found positive by a PCR test targeting a group-specific sspE genetic signature. The bacterial collection was shown to be highly diversified (143 PFGE profiles and 99 ERIC-PCR profiles) and to havean intermediate thermal profile with the coexistence of two signature sequences, the "16S rDNA-1 m" together with the "16S rDNA-2 p" signature carried by the gene coding for 16S rRNA. A predominance of the phylogenetic group III, which is potentially pathogenic, was revealed in 60.9% of the isolates. Stainless steel adhesion tests have shown that 73% of the isolates are characterized by a higher adhesion ability in their spore state than in their vegetative state. The isolates host at least one of the genes of each of the NHE and HBL complexes associated or not with the bceT, cytK-2 and ces genes. The distribution of virulence factors allowed the strains to be classified into twelve toxinogenic groups. After incubation in BHI-YE medium at 30°C, 70.7% and 35% of the strains were shown to be cytotoxic after 18 h and 5 d, respectively. Different combinations of virulence factors are significantly associated with the cytotoxic potential of bacteria. In addition, a clear link appears between the cytotoxicity of the strains and the type of food from which they are isolated.  The majority of strains were sensitive to many antimicrobial agents but showed resistance to ampicillin and novobiocin. Isolation of bacteriophages infecting the B. cereus group collection, by combining the technique of enriching samples with target bacteria followed by an analysis of the host spectrum of the lysus plates obtained, made it possible to select seven broad-spectrum bacteriophages. The latter belong to the family Siphoviridae of Caudovirales order. With the exception of two phages that had a similar protein profile, the other 5 phages each had a unique protein profile. All isolated phages have similar restriction profiles with an estimated genome size of around 37 kb. Isolated bacteriophages have been shown to be effective in preventing biofilm formation.Reductions of up to 1.5 log UFC/cm2 have been achieved compared to the untreated biofilms. The curative treatment reduced the bacterial density by 0.5 log UFC/cm2. This work confirms the health risk associated with the presence of the B. cereus group and the role of bacteriophages as a promising tool for the biocontrol of pathogenic bacteria in the agri-food chain.

Keywords : B. cereus group, food samples, contamination, diversity, health risk, biofilm, bacteriophages, biocontrol, Tunisia